大眼仔迈克（Mike Wazowski）和毛怪萨利（James P. Sullivan）是最好的朋友，不过他们可不是一开始就是这样的。想当年他们俩在怪兽大学第一次见面的时候，双方可是谁都无法忍受谁的，那么他们是怎样抛弃成见、求同存异、成为朋友的呢？这就是《怪兽大学》要讲述的故事。约翰·古德曼（John Goodman）与比利·克里斯托（Billy Crystal）将继续为毛怪萨利（Sully）和大眼仔迈克（Mike）配音，而观众在看到很多老面孔的同时也将会遇到一群新的怪兽。

影片设定在一个由精灵、巨魔和灵魂等组成的郊外幻想世界，在那里独角兽在垃圾桶中穿行，像是有着糖果条纹的负鼠。影片提供了一个前提，即魔法是真实的，但它早已被现代技术所遗忘和取代。一对十几岁的兄弟，在他们尚不更事时父亲便已离世，他们决定进入这个幻想世界，与父亲共度最后一个神奇的日子。霍兰德配音弟弟伊安、帕拉特配音聒噪的哥哥、德瑞弗斯配音兄弟二人的母亲、斯宾瑟则会利用其声线的优势。

自幼憧憬惊吓专员职业的大眼仔麦克·华斯基，终于如愿考入曾走出过无数传奇人物的怪兽大学惊吓学院。对于这个相貌讨喜、丝毫没有任何恐怖气场的小怪物来说，死啃书本似乎是实现梦想的唯一途径。与之相对，系出惊吓名门的同学毛怪詹姆士·苏利文天生是周围同学关注的焦点，完全一副什么都无所谓的浪荡公子哥做派。